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用细胞刮刀实验时
点击次数:275 发布时间:2018-09-25
   用细胞刮刀实验时
  实验步骤:无菌条件下取新生小牛大脑皮层灰质部,4℃D-Hank′s液洗涤4次,至无血迹残留。剪成1mm3左右的组织碎块并置于玻璃匀浆器内,加入两倍体积的MEM培养基,匀浆上下20次?匀浆液先用100目(直径149μm)尼龙网布式漏斗抽滤,培养基洗涤4次,收集滤液。然后用200目(直径74μm)尼龙网布式漏斗抽滤,MEM培养基洗涤4次。细胞刮刀收集200目尼龙网上的组织(即牛脑微血管),将其置于离心管中,1500r/min离心洗涤10min。离心洗涤的脑微血管悬浮于的0.1%胶原酶中,旋涡振荡15sec以充分混匀,置于37℃恒温振荡水浴箱中振荡消化50min?取出后旋涡振荡15sec,1500r/min离心10min,弃上清,用20%BCS的培养基悬。?又钟诿鹘浩瘫坏呐嘌?恐校ㄅ嘌?恐屑尤?%明胶-D-Hank′s液洗涤3ml,37℃孵箱中放置24h,用前倒掉明胶溶液即得明胶覆盖的培养瓶),置于细胞培养箱中,37℃、5%CO2、饱和湿度条件下培养。静置5~7天后,可见少量细胞生长,20%BCS的MEM培养液换液,以后每2~3天换液一次,至细胞长成致密单层后可传代培养。
  1、提前准备好Matrigel(BD 354277)包被过的六孔板,吸弃孔内包被液,加入2ml BeYaMATM 1完全培养液。
  2、吸弃待传代hESCs/hiPSCs孔内的培养液,并用1ml无钙镁的PBS洗1遍。
  3、加入0.5ml Accutase细胞分离液使之完全覆盖皿底。
  4、室温孵育5-8分钟或37℃孵育3-5分钟,显微镜下观察到大部分克隆细胞间出现间隙,细胞表面发亮但尚未相互分离时,可吸去Accutase。
  5、可将培养板放置37℃继续孵育1min,或者直接加入适量新鲜BeYaMATM 1完全培养液,轻轻摇晃,干细胞集落基本脱落。亦可用细胞刮刀将剩余克隆轻轻刮下,尽量避免用枪头反复吹打细胞。
  6、将制备好的细胞悬液按1:3-1:6的比例接种至准备好的培养板中,注意细胞过密则克隆边界不圆滑,易分化,细胞过稀则克隆存活率降低。
  7、轻轻摇晃培养板让细胞均匀分散,置于37℃,5%CO2培养箱中培养8小时。
  8、每天更换培养液,待细胞密度达到80%以上,或者克隆中央密度过大,影响细胞生长时进行传代。
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